萤光素酶检测系统

2018/9/7 14:25:31

1 介绍

1.1 报告基因已被细胞生物学广泛使用以研究基因表达及其它与基因表达相关的细胞学事件，例如：受体活性，细胞内信号传导，mRNA 加工，蛋白质折叠及蛋白-蛋白相互作用等。
1.2 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是一种以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)活性的试剂盒。
1.3 萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin。在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。原理图如下图。
1.4 在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。本检测快速，每个样品只需几秒钟。
本试剂盒可以测定100个样品。

2 萤光素酶检测系统

每个系统包含足够100 次标准检测的试剂。包括：
1 瓶     萤光素酶检测底物溶液
1 瓶     ATP母液
1 瓶     萤光素酶检测缓冲液
1 瓶     细胞培养裂解液，5X

3 保存条件

细胞裂解液-20ºC保存一年有效， 4 ºC三个月有效；萤光素酶检测试剂-20ºC避光保存6个月有效，-80ºC避光保存一年有效。

4 使用说明

4.1 裂解细胞：吸掉细胞培养皿中的培养基，用PBS洗涤一次。将5X的细胞培养裂解液用水稀释到1X，充分混匀后，足量加入到细胞培养皿中（如400μL/60mm培养皿，900μL /100mm，30μL /96孔板）充分裂解细胞。
4.2 充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。如果在96孔板中裂解细胞可不离心直接转移到96孔板中进行测定。
注：细胞裂解后可立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
4.3 融解萤光素酶检测底物溶液，并达到室温。
备注：第一次溶解后必须用避光管将其分装，反复冻融会降低检测效率。
4.4 按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为5秒。
4.5 每个样品测定时，取样品20-100微升(如果样品量足够，请加入100微升；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。
4.6 加入100微升（与样品加入量相同，如加入30μL样品，则检测试剂同样加入30μL）萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定。以报告基因细胞裂解液为空白对照。