在细胞培养过程中，培养液的pH值必须维持在适宜水平，并能随着时间的推移保持稳定。

目前，大多数（但不是全部）细胞培养液采用碳酸盐缓冲体系，以控制和稳定pH值，通常通过添加一定量的碳酸氢钠来实现。在生物体内，碳酸盐-二氧化碳（CO2）缓冲系统可以由肺（CO2）和肾脏（碳酸氢盐）来主动调节，使pH值保持在一个最佳水平，而在细胞培养中，培养箱中的二氧化碳可与培养液中的碳酸氢盐共同作用，以实现这一目的。
 
不同动物细胞适用的培养液pH值有所不同，多数哺乳动物细胞在pH值为7.2-7.4时生长良好。当然，这是理想数值，在实际工作中，会发现细胞培养液的pH值会随着时间发生变化。比如，在不更换培养液的情况下，细胞培养一段时间后，会注意到培养液变为橙黄色。
 
颜色上的变化，来源于培养液中添加的pH指示剂—酚红。含有酚红的溶液在pH值为6.8及以下时呈现黄色。随着pH值的上升，颜色会逐渐变红，直至达到7.6 时，溶液呈现出粉红色，在pH值为8.2以上时又变成明亮的紫红色（见下图）。这些可视化的改变，可帮助我们快速判断细胞的生长情况。
 
一般来说，培养液呈橙红色，这是哺乳动物细胞生长的健康的pH值条件，此时pH值为7.0-7.7。如果颜色呈亮黄色（过酸）或紫红色（过碱），说明细胞生长出现了状况。
 
一方面，培养液通常会或多或少的酸化。细胞生长过密或时间过长，酸性代谢产物累积会导致培养液pH值下降；此外，若培养液被细菌和酵母菌污染且过度生长，pH值也会下降；而低氧条件下的培养液pH值也会降低，因为低氧环境促进了细胞代谢的乳酸堆积。
 
另一方面，当培养液开封后在冰箱中放置的时间过长，或者培养箱中的二氧化碳水平降低，会观察到培养液变成紫红色，此时，培养液的pH值升高。
 
实际上，培养液中基于碳酸盐的缓冲体系是为培养箱中特定的CO2水平而配制的。一些细胞类型可能更喜欢培养液中更高或更低的碳酸氢盐浓度，这就要求在细胞培养液的孵化过程中采用更高或更低的CO2浓度，以维持生理上的pH值。
 
由于室内空气中的CO2含量要低得多（低于1%），即使是轻微的干扰，例如打开培养箱的门，也会导致培养箱内CO2水平的改变。与此同时，由于水的解离常数会随着温度的降低而降低，都会对培养液的pH值造成影响。
 
因此，基于让细胞和培养液保持在恒定的CO2浓度和温度下的原则，在培养箱外进行细胞操作时，应尽量减少操作时间，在从培养箱取出细胞之前，应准备好细胞操作需要的其他材料，同时，培养液温度至少要恢复到室温，以减少细胞对低温的应急反应。
 
为减少CO2水平以及温度变化给培养液和细胞带来的影响，在培养箱外处理细胞时，可考虑使用添加非碳酸盐缓冲剂（如HEPES）的培养液。
 
HEPES的解离常数随着温度的下降而下降，这点与水类似，这种特性使得HEPES缓冲体系更适应培养箱外的室温环境和较低的CO2水平，这在维持细胞生理功能方面优于碳酸盐缓冲体系。但如果培养液长时间接收光照，HEPES会与培养液中的色氨酸及其他成分发生反应，产生对细胞有害的活性氧（自由基），影响细胞的正常生理功能。因此使用含有HEPES的培养液，最好将培养液瓶用铝箔纸覆盖以避免光照。
 
基于上述原因，除非必要，尽量不要使用含有HEPES的培养液，尤其在CO2培养箱中培养细胞时。尽管含HEPES的培养液能够维持更恒定的pH值，即使细胞过度增殖，培养液也不容易变黄，但这并非使用含HEPES培养液的目的。恰恰相反，加入酚红指示剂的目的之一就是通过培养液的颜色变化来及时了解细胞的生长状态，从这个角度考虑，含HEPES的培养液也不适合用来长期培养细胞。